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ABCD - Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva - Brazilian Archives of Digestive Surgery

Número: 27.3 - 19 Artigos

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Artigo Original

Associação do Papilomavírus humano com o adenocarcinoma colorretal e sua influência no estadio tumoral e no grau de diferenciação celular

Association between human Papillomavirus and colorectal adenocarcinoma and its influence on tumor staging and degree of cell differentiation

Olavo Magalhães PICANÇO-JUNIOR, Andre Luiz Torres OLIVEIRA, Lucia Thereza Mascarenhas FREIRE, Rosangela Baia BRITO, Luisa Lina VILLA, Délcio MATOS

Resumo

RACIONAL: O câncer colorretal é uma das neoplasias mais frequentes entre a população adulta mundial, e entre as do trato gastrointestinal, é a segunda em relação à prevalência e mortalidade sendo a sua causa conhecida apenas em cerca de 5% dos casos. Acredita-se que 15% das doenças malignas estariam relacionadas à oncogênese viral. OBJETIVO: Correlacionar a presença do HPV com o estadiamento e o grau de diferenciação celular dos pacientes portadores de adenocarcinoma colorretal. MÉTODOS: Foi realizado um estudo retrospectivo do tipo caso-controle com 144 pacientes divididos em um grupo teste representado por pacientes com câncer colorretal em um total de 79 casos e um grupo controle correspondente à pacientes com doença benigna totalizando 65 casos. Após a aplicação dos critérios de exclusão, foi possível analisar 144 pacientes com idade entre 25 a 85 anos (média de 57,85 anos com desvio-padrão de 15,27 anos e mediana de 58 anos). Oitenta e seis (59,7%) pacientes eram homens. Amostras teciduais a partir de blocos de parafina de ambos os grupos foram submetidos à extração do DNA e em seguida foi realizada reação em cadeia da polimerase com iniciadores genéricos e específicos para HPV 16 e 18 e também a hibridização do tipo dot blot com o intuito de identificar o DNA do HPV. RESULTADOS: Os grupos se mostraram homogêneos quanto a sexo, idade e localização do HPV nas amostras analisadas. Dos 41 pacientes com HPV, 36 (45,6%) eram do grupo teste e cinco (7,7%) do grupo controle (p<0,001). Todos os casos de HPV observados correspondiam ao HPV 16 não sendo evidenciado HPV 18 em nenhum caso estudado. Não houve diferença significativa na comparação realizada quando se considerou o sexo, idade e localização no que tange a presença do HPV em ambos os grupos. Não observou-se diferença significativa em relação ao estádio e ao grau de diferenciação celular dos pacientes portadores de câncer colorretal. CONCLUSÃO: O papilomavírus humano tipo 16 está presente em indivíduos portadores de carcinoma colorretal. No entanto, não está relacionado com o estadiamento e o grau de diferenciação.

Palavras-chave: Infecções por papilomavírus, Carcinoma, Neoplasias colorretais, Estadiamento de neoplasias, Diferenciação celular

O câncer colorretal é uma das neoplasias mais frequentes entre a população adulta mundial, e entre as do trato gastrointestinal, é a segunda em relação à prevalência e mortalidade sendo a sua causa conhecida apenas em cerca de 5% dos casos. Acredita-se que 15% das doenças malignas estariam relacionadas à oncogênese viral.

OBJETIVO:

Correlacionar a presença do HPV com o estadiamento e o grau de diferenciação celular dos pacientes portadores de adenocarcinoma colorretal.

MÉTODOS:

Foi realizado um estudo retrospectivo do tipo caso-controle com 144 pacientes divididos em um grupo teste representado por pacientes com câncer colorretal em um total de 79 casos e um grupo controle correspondente à pacientes com doença benigna totalizando 65 casos. Após a aplicação dos critérios de exclusão, foi possível analisar 144 pacientes com idade entre 25 a 85 anos (média de 57,85 anos com desvio-padrão de 15,27 anos e mediana de 58 anos). Oitenta e seis (59,7%) pacientes eram homens. Amostras teciduais a partir de blocos de parafina de ambos os grupos foram submetidos à extração do DNA e em seguida foi realizada reação em cadeia da polimerase com iniciadores genéricos e específicos para HPV 16 e 18 e também a hibridização do tipo dot blot com o intuito de identificar o DNA do HPV.

RESULTADOS:

Os grupos se mostraram homogêneos quanto a sexo, idade e localização do HPV nas amostras analisadas. Dos 41 pacientes com HPV, 36 (45,6%) eram do grupo teste e cinco (7,7%) do grupo controle (p<0,001). Todos os casos de HPV observados correspondiam ao HPV 16 não sendo evidenciado HPV 18 em nenhum caso estudado. Não houve diferença significativa na comparação realizada quando se considerou o sexo, idade e localização no que tange a presença do HPV em ambos os grupos. Não observou-se diferença significativa em relação ao estádio e ao grau de diferenciação celular dos pacientes portadores de câncer colorretal.

CONCLUSÃO:

O papilomavírus humano tipo 16 está presente em indivíduos portadores de carcinoma colorretal. No entanto, não está relacionado com o estadiamento e o grau de diferenciação. Palavras-Chave: Infecções por papilomavírus; Carcinoma; Neoplasias colorretais; Estadiamento de neoplasias; Diferenciação celular

INTRODUÇÃO

O câncer colorretal é doença multifatorial e possibilita estudá-lo desde suas formas iniciais até as mais avançadas, possibilitando a observação dos mecanismos que poderiam estar envolvidos em seu desenvolvimento, evidenciando desta forma as múltiplas etapas genéticas relacionadas ao processo de carcinogênese28.

Existem evidências que elementos dietéticos e ambientais desempenham papel importante no desenvolvimento do câncer colorretal (CCR)19. Segundo Giuliani7, vários fatores estariam envolvidos na carcinogênse colorretal incluindo os relacionados ao estilo de vida, alterações genéticas sequenciais e infecção viral.

O papiloma vírus humano (HPV) é o causador de uma das doenças sexualmente transmissíveis de maior prevalência no mundo, havendo trabalhos na literatura médica que o correlacionam com o desenvolvimento de adenocarcinoma no cólon2 , 3 , 5 , 18; entretanto, mais comumente está relacionado ao desenvolvimento de câncer do canal anal3 , 12 , 24 e principalmente cervicouterino15 , 16 , 21 , 26 , 27.

Em função destes dados e do potencial carcinogênico do HPV já confirmado no colo uterino e canal anal, faz-se necessário a detecção e identificação do papilomavírus como um fator predisponente para a carcinogênese colorretal o que poderia proporcionar a identificação de grupos de risco, bem como auxiliar no desenvolvimento de novas terapêuticas baseados no entendimento da biologia desta doença18.

O objetivo deste estudo foi buscar possível associação entre o HPV e o adenocarcinoma colorretal bem como a possibilidade desta relação com fatores prognósticos desta doença como o grau de diferenciação celular e o estadio dos pacientes.

MÉTODOS

Este estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brasil, sob o número 1377/08. Trata-se de um estudo do tipo caso controle, realizado em parceria com o Hospital Ophir Loyola e Instituto Ludwig de pesquisa sobre o Câncer.

Pacientes

Foram selecionados inicialmente um total de 182 pacientes no período de janeiro de 1999 a dezembro de 2003 divididos em dois grupos que após a aplicação de critérios de exclusão e inclusão compuseram um total de 79 casos para o Grupo Teste (GT) e 65 casos para o Grupo Controle (GC). Os critérios de inclusão utilizados foram pacientes admitidos no Hospital Ophyr Loiola, Belém, PA, Brasil para tratamento e investigação diagnóstica de acordo com o grupo ao qual foram alocados, classificados de acordo com o sistema TNM, e que possuíssem prontuário médico e blocos de parafina com o tumor primário, arquivados no Departamento de Patologia, bem como os blocos dos pacientes que foram submetidos apenas à biópsia.

Os casos onde não foi possível se obter DNA viável para a realização de PCR foram excluídos, totalizando três casos no GT e 12 casos no GC. Outros cinco casos do GC foram excluídos devido a terem sido diagnosticados como adenomas, e os submetidos à radioterapia prévia.

Com relação aos dados descritivos os pacientes foram representados por 40,3% de mulheres e 50,7% de homens. A maioria dos casos estavam na 5a década de vida (67,2%) e a localização retal corespondeu à 53,5% das lesões. A distribuição em relação ao estádio clínico foi representada por 10 casos no estádio I (12,7%), 27 no II (34,2%), 26 no III (32,9%) e 16 no IV (20,3%). A totalidade dos casos do GT eram representados por amostras de pacientes com adenocarcinoma colorretal. O GC tinha pacientes com mucosa normal (n=1, 0,7%), lesão inflamatória da mucosa (n=35, 24,3%), lesão polipóide da mucosa (n=28, 19,4%) e hipoaganglionose (n=1, 0,7%).

Diagnóstico histopatológico

Após a coleta as amostras de tecido eram imediatamente imersas em solução de formol a 10% tamponado para preservação do material e encaminhadas patologia, fixados em formol, incluídos em parafina e processados por técnicas histopatológicas padrão. A avaliação diagnóstica era realizada por patologistas da instituição e as amostras que se enquadraram nos GT e GC eram selecionadas para a pesquisa.

Após esta seleção eram realizadas secções nos blocos de parafina contendo material genético dos casos selecionados e enviados em tubos estéreis ao Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer em São Paulo para realização de reação em cadeia da polimerase - PCR.

Extração do DNA e PCR

Seções do tecido parafinado eram submetidas ao processo de desparafinização e digestão enzimática com proteinase K (200 µg/ml) a 56° C, durante dois a quatro dias. Após a digestão, procedeu-se à extração do DNA pelo método fenol-clorofórmio preconizado por Sambrook22.

Após a extração e purificação, as amostras de DNA eram inicialmente submetidas à reação em cadeia mediada pela polimerase (polymerase chain reaction, PCR) utilizando iniciadores ou primer (oligonucleotideos iniciadores a serem utilizados em reações de amplificação de PCR) PCO3 e G74 que amplificam 100 pares de bases (pb) do gene ß-globina humana1 objetivando avaliar a suficiência e integridade do DNA presente em cada amostra.

As amostras positivas eram submetidas à PCR com iniciadores genéricos para HPV, GP5+/GP6+8, capazes de amplificar 140 pb do gene L1 de HPV.

Para demonstrar que não houve contaminação por DNA exógeno foi utilizado controle negativo, contendo todos os reagentes da mistura, exceto o DNA. Uma linhagem de células HeLa que continha o DNA de HPV 18 integrado29 foi utilizada como controle positivo.

As amplificações foram efetuadas no equipamento termociclador, Epperndorf, modelo Mastercycle gradiente. Quarenta ciclos de amplificação foram efetivados empregando 1 min para a desnaturação a 95° C, 1 min de anelamento a 55° C e 1,5 min para o alongamento da cadeia a 72° C.

Os produtos da amplificação também chamados amplicons foram analisados em gel de poliacrilamida a 7% corados pela prata.

Identificação de HPV por hibridização em pontos (Dot Blot)

Este método se baseia nos princípios gerais de hibridização, onde o produto amplificado é desnaturado e fixado em pontos em uma membrana de náilon. Os procedimentos de fixação do amplicon na membrana incluem aquecimento ou irradiação UV. Em seguida a membrana é recoberta com sondas específicas (isoladamente ou em coquetéis) para os HPV tipos 6,11,16,18,31,33,34,35,39,40,42,43,44,45,51,52,54,56 e 58 marcadas com fósforo radioativo (P32). A hibridização é revelada após exposição das membranas ao filme de RX por 18 a 36 horas à 70°C. A hibridização com a sonda é reconhecida como evidência de que a seqüência nucleotidica pesquisada esta presente no espécime.

Em cada membrana utilizou-se, além dos controles positivos e negativos dos produtos da PCR, controles para diferentes tipos de HPV, provenientes de amplificações por PCR de plasmídeos e amostras clínicas.

Posteriormente, as membranas foram umedecidas com solução 2xSSC e colocadas em um saco plástico com 5 mL da solução 6xSSC, 10x Denhardt's, 0.5% SDS e 100µg de esperma de salmão desnaturado, sendo em seguida encubadas a 55° C por três horas (pré-hibridização).

Em seguida, adicionou-se as sondas radioativas à solução anterior, permanecendo incubadas a mesma temperatura por 12 a 24 h (hibridização); ao fim deste período, lavaram-se as membranas com solução 3xSSC, 0,5%SDS, em três etapas: a primeira por 10 min à temperatura ambiente e as outras duas por 30 min cada, à 55° C. Finalmente, as membranas foram expostas a um filme de RX (X-OmatK-Kodak) durante 18 a 36 horas à -70° C e a hibridização foi verificada após a revelação do filme, pela presença de pontos escuros no local correspondente às amostras adicionadas à membrana.

PCR específica para E7 de HPV 16 e 18

As amostras foram utilizadas em uma PCR com iniciadores específicos para E7 do HPV 16 e 18, capazes de amplificar 217 pb para E7 de HPV 16 e 137 pb para E7 de HPV 18. Com relação aos iniciadores específicos para o HPV 16 foram utilizados: 5´ GCC CAT TAA CAG GTC TTC C 3´ ; 5´ TTT GCA ACC AGA GAC AAC TGA 3´. Para o HPV 18 : 5´ ATG TCA CGA GCA ATT AAG C 3´; 5´ TTC TGG CTT CAC ACT TCA AAC A 3´ .

As amplificações foram efetuadas no equipamento termociclador, Epperndorf, modelo Mastercycle gradiente. Quarenta ciclos de amplificação foram efetivados empregando 1 min para a desnaturação à 95° C, 1 min de anelamento à 55° C e 1,5 min para o alongamento da cadeia à 72° C.

Os produtos da amplificação também chamados amplicons foram analisados em gel de poliacrilamida a 7% corados pela prata e analisados de forma semelhante aos para PCR genérica.

Análise estatística

Os resultados obtidos foram inicialmente submetidas à análise descritiva de todas as variáveis. Para as quantitativas ela foi feita através da observação dos valores mínimos e máximos, e do cálculo de médias, desvios-padrão e mediana. Para as variáveis qualitativas foi realizado o cálculo das frequências absolutas e relativas. Para se testar a homogeneidade entre as proporções foi utilizado o teste qui-quadrado ou o exato de Fisher quando ocorreram frequências esperadas menores do que cinco. Foi adotado o nível de significância de 5% para rejeição da hipótese de nulidade nas amostras analisadas.

RESULTADO

Durante o desenvolvimento da pesquisa foram excluídos do GT três casos devido à negatividade para o teste do gene da ß globina humana para identificação de DNA viável. Da mesma forma no GC foi necessário excluir oito casos o que totalizou 65 casos no GC após a exclusão de outros cinco casos devido se tratarem de adenomas e 79 casos para o GT viáveis mostrando positividade para o gene da ß globina humana em 92,9% das amostras.

Com a aplicação dos critérios de exclusão pôde-se analisar 144 pacientes com idade entre 25 a 85 anos (média de 57,85 anos com desvio-padrão de 15,27 anos e mediana de 58 anos). Oitenta e seis (59,7%) pacientes eram homens.

A presença do HPV foi observada em 41 pacientes, o que representou 28,5% do total de casos, tendo sido identificado apenas a presença do HPV 16 em todos os casos e, mesmo com a utilização de hibridização e PCR específica para o HPV 18, ele não foi encontrado em nenhum dos casos.

Setenta e nove (54,9%) pacientes apresentaram adenocarcinoma colorretal (GT) e 65 (45,1%) foram considerados como integrantes do GC.

Os grupos não apresentaram diferença significativa em relação a sexo, idade e localização do tumor o que representa a homogeneidade entre os grupos.

Dos 41 pacientes com HPV, 36 (45,6%) eram do GT e cinco (7,7%) do GC. Portanto houve diferença significativa entre os grupos (Tabela 1). O GT apresentou maior percentual de casos onde se identificou a presença do HPV quando comparado ao GC (teste qui-quadrado, p<0,001).

Tabela 1 Caracterização dos pacientes segundo a presença ou ausência do DNA do HPV em ambos os grupos estudados 

 

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